Вот уже скоро 2 года, как весь мир живет под знаком ковида. В борьбе с этой напастью огромную роль суждено сыграть научным разработкам в области вакцин и лекарств. Поэтому было естественно ожидать, что Нобелевские премии текущего года будут как-то отражать эту ситуацию. Но Шведская Академия наук в своем решении о присуждении Нобелевских премий за 2021 г. вообще никак не отреагировала на пандемию. На самом деле я, как и многие в научном мире, надеялся, что Нобелевская премия за 2021 г. будет присуждена Каталин Карико (Katalin Karikó) и Дрю Вайсману (Drew Weissman), чьи пионерские работы начала текущего века открыли путь к созданию вакцин, основанных на совершенно новом принципе. Я кратко расскажу здесь об этих ученых и об их работе, приведшей, в конечном счете, к разработке наиболее эффективных вакцин против ковида.
За более чем 200-летнюю историю вакцинации против вирусных инфекций, таких как оспа, корь, полиомиелит и т.д., в качестве вакцин использовался либо убитый, либо ослабленный патоген. С развитием молекулярной биологии и генной инженерии в последнюю четверть XX века стали использовать так называемые векторные вакцины, которые, как правило, представляют собой генетически модифицированный аденовирус, в ДНК которого вставлен ген, кодирующий важный белок патогена. В случае вакцин против ковида такие векторные вакцины производятся компаниями AstraZeneca и Johnson & Johnson (к этому же типу относится русская вакцина «Спутник V»). Научное открытие, сделанное Каталин Карико и Дрю Вайсманом в начале текущего века, позволило разработать вакцину принципиально нового типа, где активным началом служит молекула РНК, кодирующая важный белок патогена. До пандемии ковида ни одной вакцины такого типа не было произведено. Производство РНКвых вакцин компаниями Pfizer/BioNTech и Moderna сыграло и продолжает играть ключевую роль в борьбе с пандемией, в особенности в США, Европе и Израиле.
Drew Weissman and Katalin Karikó
Вообще, иммуногеном, то есть веществом, вызывающим специфический иммунный ответ против данного патогена, для любой вакцины служат молекулы белка, специфичные к патогену. В случае вакцин против ковида таким белком является S-белок, из которого состоят «шипы» на поверхности вирусной частицы, из-за которых коронавирус и получил свое название. Если вакциной служит убитый или ослабленный вирус, иммуноген, т.е. S-белок, присутствует как часть вводимого материала. В случае векторных вакцин генетически модифицированный аденовирус проникает в клетки пациента, после чего происходит цепочка событий. Сначала в клеточном ядре, куда проникла ДНК аденовируса, с помощью клеточного фермента РНК-полимеразы с гена, кодирующего S-белок, синтезируется РНКовая копия, которая называется матричной РНК, мРНК (mRNA), см. Рис. 1. Этот процесс называется транскрипцией.
Затем следует процесс, называемый трансляцией, который происходит в цитоплазме той клетки, в ядро которой проникла ДНК аденовирусного вектора. На этом этапе происходит перевод генетического текста с языка нуклеотидов (из которых построена ДНК и РНК) на язык аминокислот, из которых построены белки. Так что в случае вакцинации векторной вакциной конечным звеном цепочки событий является иммуноген: в нашем случае S-белок коронавируса, против которого организм и вырабатывает иммунный ответ.
Рис. 1. Синтез белка в клетке
В процессе транскрипции на участке ДНК, который называется «ген», синтезируется мРНКовая копия гена. В клетках, в которых есть клеточное ядро, как у нас с вами, транскрипция осуществляется внутри ядер. Затем мРНК (mRNA) перемещается в цитоплазму клетки, где на специальных молекулярных машинах-рибосомах происходит процесс трансляции: синтез молекулы белка по инструкции, содержащейся в последовательности звеньев (называемых нуклеотидами или нуклеозидами) молекулы мРНК. Этот перевод с языка нуклеотидов на язык аминокислот, из которых построен белок, осуществляется согласно Генетическому коду.
Уже на заре молекулярной биологии возникла идея, как можно упростить процесс выработки в нашем организме нужного белка (не обязательно иммуногена), т.е. обойтись без вектора. Чего проще! Синтезировать нужную нам мРНК в пробирке (как говорят биологи, in vitro) при помощи РНК-полимеразы. Такой процесс легко осуществим, он называется «in vitro транскрипция». Для этого нужны, кроме фермента, который доступен, только кусок ДНК, несущий нужный ген, и 4 предшественника звеньев, из которых построена РНК (A, G, C и U, называемых нуклеотидами или нуклеозидами). Такую синтетическую РНК надо доставить в клети организма, где по записанной на ней инструкции начнется синтез соответствующего белка. Идея казалась весьма заманчивой, и в случае ее успеха открывались невероятные перспективы не только в области вакцин, но и чуть ли не во всех областях медицины.
На протяжении 80-х и 90-х годов прошлого века идея вновь и вновь апробировалась и эти попытки давали, в общем, обнадеживающие результаты, но прорыва не происходило. Постепенно у молекулярных биологов сложилось мнение, что этот путь тупиковый. Одни говорили, что, мол, РНК слишком нестабильная молекула, чтобы ее можно было надежно использовать таким образом. Другие говорили, что внедрить такой подход в медицинскую практику будет слишком дорого. Третьи указывали на то, что получаемая путем in vitro транскрипции синтетическая РНК вызывает воспалительные процессы, и поэтому основанным на ее использовании медицинским препаратам никогда не пройти клинические испытания.
Находилось очень мало энтузиастов, продолжавших заниматься разработкой этого подхода, и им приходилось нелегко. Одной из очень немногих была Каталин Карико. Карико родилась и выросла в Венгрии, там же получила хорошее образование в области молекулярной биологии в университете Сегеда и защитила диссертацию на степень PhD. Она очень рано стала энтузиастом подхода, основанного на мРНК, и, не найдя поддержки таким исследованиям в Венгрии, эмигрировала с семьей в США в середине 1980х годов. Вскоре ей пришлось убедиться, что перспективы получить финансовую поддержку своим исследованиям в США для нее не лучше, чем в родной Венгрии. В результате у нее начались крупные неприятности. Все ее заявки на получение грантов неизменно отклонялись, и в конечном счете в 1995 г. ее поставили перед выбором в Университете штата Пенсильвания (UPenn), где она работала: либо искать другую работу, либо согласиться на унизительное понижение в должности (и в зарплате).
Она еще не успела уйти из UPenn’а, когда ей (да и всем нам) крупно повезло. Зайдя в комнату, где стаял ксерокс, чтобы скопировать какую-то статью, она столкнулась с недавно перешедшим в UPenn профессором Дрю Вайсманом*. Они разговорились, каждый рассказал о своих научных интересах. Вайсман занимался иммунологией, и Карико немедленно стала его убеждать, что он сможет достичь неслыханных успехов в своей работе, если с ее (Карико) помощью научится, используя синтетическую мРНК, перепрограммировать клетки так, чтобы они вырабатывали, по заданию экспериментатора, белки (в частности, иммуногены) непосредственно в живом организме. Как это ни поразительно, ей удалось убедить Вайсмана, который имел финансирование, направить часть ресурсов своей вновь созданной в UPenn’е лаборатории на попытку создать новую технологию, основанную на использовании синтетических мРНК. Как довольно часто бывает, открытие, приведшее к прорыву, было сделано случайно. Заслуга исследователей подчас состоит лишь в том, чтобы обратить внимание, не пройти мимо. Как же это было в данном случае?
В любом биологическом эксперименте необходим негативный контроль. Если вы впрыскиваете в мышь специально приготовленную синтетическую мРНК и хотите наблюдать, как мышь на эту мРНК реагирует, вы должны параллельно ввести в другую мышь тоже РНК, но такую, которая заведомо не может кодировать тот белок, который кодирует приготовленная вами мРНК. В живой клетке, помимо мРНК разного рода, есть еще разнообразные типы молекулы РНК, такие как рибосомальные РНК (рРНК), транспортные РНК (тРНК), митохондриальные РНК (мтРНК). Карико и Вайсман выбрали в качестве контроля тРНК: это короткие молекулы, которые не могут в принципе кодировать никакие белки. Они наблюдали ожидаемый эффект от приготовленной ими мРНК, т.е. кодируемый этой мРНК белок явно вырабатывался в мыши, и не наблюдали никакого эффекта в контрольном эксперименте, когда вместо мРНК использовалась тРНК. Все отлично, можно двигаться дальше. Подавляющее большинство исследователей так бы и поступило и… проморгало бы важнейшее открытие. А Карико с Вайсманом обратили внимание на вроде бы не имеющий прямого отношения к делу факт: если в экспериментальной группе мышей явно наблюдались воспалительные процессы, типичные для синтетической мРНК, получаемой путем in vitro транскрипции, то в контрольной группе мышей никаких воспалений не наблюдалось. В чем дело? Выходит, что введенная извне РНК вовсе не обязательно вызывает воспалительные процессы, как все считали? Потянув за эту ниточку, мы, может быть, сможем научиться избегать воспалительных процессов при введении синтетической мРНК, рассуждали исследователи. А ведь это сняло бы одно из важнейших возражений против медицинских применений синтетических мРНК!
Карико и Вайсману удалось распутать этот клубок вопросов, и в 2005 г. они опубликовали статью, в которой было выяснено, как и почему одни молекулы РНК вызывают воспалительные процессы, а другие нет. Оказалось, что все определяется присутствием (или отсутствием) в РНК химически модифицированных звеньев (нуклеотидов или нуклеозидов). Если модифицированных звеньев в вводимой РНК нет, как в случае синтетической мРНК, получаемой путем in vitro транскрипции, то наблюдается острая воспалительная реакция. Если использовать для инъекций разные типы РНК (рРНК, тРНК, мтРНК), то, чем большая доля звеньев в РНК модифицирована, тем слабее воспалительная реакция. Они поняли, что тРНК в их исходных опытах (где она служила негативным контролем), не вызывала воспалительных процессов потому, что она буквально напичкана модифицированными нуклеозидами. Ну а чтобы проделать решающие опыты, окончательно доказавшие, что воспалительная реакция зависит от степени химической модификации РНК, Карико и Вайсман стали делать in vitro транскрипцию, добавляя к смеси 4х предшественников канонических нуклеозидов (аденозина, A; гуанозина, G; цитидина, C и уридина, U) предшественники различных химически модифицированных нуклеозидов. Это всегда приводило к уменьшению воспаления, но в разной степени. Особенно сильно уменьшалось воспалительная реакция при замене уридина на псевдоуридин (Рис. 2).
уридин U псевдоуридин
Рис. 2. Нуклеозиды уридин и псевдоуридин очень похожи друг на друга, но, как показали Карико и Вайсман, замена даже части уридинов в РНК на псевдоуридины резко снижает способность РНК вызывать воспалительные процессы.
Воспалительные процессы при введении немодифицированной РНК являются проявлением иммунной реакции организма. Но это не тот иммунитет, о котором все наслышаны, в котором участвую Т- и В- лимфоциты и иммуноглобулины. Такой всем известный иммунитет называют приобретенным иммунитетом (adaptive immunity). Широкая публика гораздо меньше наслышана о том, что в конце XX века был открыт еще один тип иммунитета, получивший название врожденного иммунитета (innate immunity). В отличие от системы приобретенного иммунитета, которая распознает тонкие отличия между разными молекулами белков всевозможных патогенов, система врожденного иммунитета распознает глобальные отличия основных молекулярных маркеров, общих для обширного класса патогенов, от молекулярных маркеров «своих» клеток. В частности, система врожденного иммунитета реагирует на появление в организме химически немодифицированных молекул РНК как на сигнал о проникновении патогена, так как «свои» молекулы РНК в разной степени модифицированы, а РНК бактерий и вирусов практически не несут модифицированных звеньев (которые называются нуклеотидами или нуклеозидами). Подобно реакции системы приобретенного иммунитета, реакция системы врожденного иммунитета проявляется в виде воспалительных процессов.
Работа Карико и Вайсмана 2005 года проломила лед в отношении научного сообщества и инвесторов к возможным медицинским применениям мРНК. Стало ясно, что использование псевдоуридинов вместо уридинов в ходе in vitro транскрипции позволит полностью избежать воспалительных процессов при применении синтетических мРНК. Вскоре возникли биотехнологические компании, которые стали работать в этом направлении, наиболее известные из которых — бостонская Moderna и немецкая BioNTech. Карико стала вице-президентом немецкой компании. Надо сказать, впрочем, что существенных успехов в создании новых лекарств на основе технологии мРНК не произошло вплоть до пандемии ковида, и есть основания предполагать, что не случись пандемия, эта технология, скорее всего, опять бы оказалась в загоне. Важно то, что к моменту возникновения пандемии обе компании еще держались на плаву, и они оказались абсолютно готовы к тому, чтобы приступить к немедленной разработке вакцин против ковида на основе мРНК-технологии. Буквально через несколько дней после того, как китайские вирусологи вывесили в сети последовательность нуклеотидов РНК коронавируса, дизайн вакцины был готов и в компании Moderna, и в компании BioNTech.
Следует подчеркнуть, что кроме прорыва, произведенного Карико и Вайсманом, для того, чтобы мРНКовые вакцины стали реальностью, многим исследователям необходимо было проделать гигантскую работу. Надо было научиться стабилизировать РНК, чтобы она не деградировала, попав в организм. Надо было разработать специальные носители, внутри которых РНК проникает в клетку. Это так называемые липидные наночастицы, и их внедрение было важнейшим этапом на пути к РНК-вакцинам. Разработка всего этого ноу-хау потребовала многолетних усилий и университетских лабораторий, и биотехнологических компаний.
Так что не из ложной скромности Карико, в одном из своих интервью, сказала: «Просто каждый добавил немного, в том числе и я». В принципе, так оно и было в отношении всех, кроме нее самой и Вайсмана. Но, хотя Карико и Вайсман уже получили ряд престижных премий, Нобель пока им не достался.
Примечание
* Вайсман получил первоклассное образование в Бостоне. Он окончил Университет Брандайза и получил степени PhD и MD в Бостонском университете. Университет Брандайза (названный именем первого в истории судьи еврейского происхождения, назначенного в Верховный суд США) был создан вскоре после Второй мировой войны в пику Гарварду, который в то время занимал антисемитскую позицию и в отношении приема студентов, и в отношении найма профессоров (эта позиция изменилась только после принятия Конгрессом антидискриминационных законов при президенте Линдоне Джонсоне). Я неплохо знал ныне покойного научного руководителя Вайсмана в Брандайзе, профессора Джеральда Фасмана, который был крупным специалистом в области биофизики белков.
Оригинал: https://7i.7iskusstv.com/y2021/nomer10/mfrank/
